Einleitung
Neue psychoaktive Substanzen (NPS) sind neuartige Analoga bereits gesetzlich regulierter psychoaktiver Substanzen. NPS stellen eine sehr vielfältige Gruppe von Verbindungen dar, die basierend auf ihrer chemischen Struktur in neun verschiedene Gruppen unterteilt sind [^1^]. Eine dieser Gruppen sind N-Benzylphenethylamine (NBPEAs, Schema 1), hochpotente Agonisten des Serotonin 2A-Rezeptors (5-HT2AR), die aus den Phenethylaminen durch Funktionalisierung der freien Aminogruppe durch einen substituierten Benzylmolekül entstehen [^2^,^3^]. NBPEAs repräsentieren eine umfangreiche, vielfältige und verbreitete Gruppe von psychedelischen Verbindungen, die aufgrund ihrer rekreativen, therapeutischen und wissenschaftlichen Verwendungen große Aufmerksamkeit erregt haben [^3^]. Das Verständnis des Stoffwechsels dieser Substanzen ist sowohl aus pharmakologischer als auch aus toxikologischer Sicht von großem Interesse.
2-(8-Brom-2,3,6,7-tetrahydrobenzo[1,2-b:4,5-b’]difuran-4-yl)-N-(2-methoxybenzyl)ethan-1-amin (2C-B-Fly-NBOMe, Verbindung 1; Schema 1), eine Substanz aus der Gruppe der NBPEAs, wurde erstmals in einem Poster von 1999 berichtet, das die Ergebnisse einer Suche nach potenten und stereoselektiven 5-HT2AR-Antagonisten und seinen neuen Agonisten als Werkzeuge für die Erforschung der 5-HT2AR-vermittelten Funktionen vorstellte [^4^]. Die Substitution der Aminogruppe durch eine Benzylgruppe mit einem Methoxy (NBOMe) oder Hydroxy (NBOH) Substituenten in der ortho-Position führt zu einer extremen Potenzsteigerung an den 5-HT2-Rezeptoren [^5^,^6^]. Dieses Gerüst wurde weiter von Ralf Heim untersucht, der eine Vielzahl von neuartigen N-Benzylphenethylamin-Analoga entwickelt und analysiert hat [^7^]. Die N-Benzylsubstitution des Phenethylamins zeigt nicht nur eine hohe Bindungsaffinität an den 5-HT2AR und den Serotonin 2C-Rezeptor (5-HT2CR) [^2^,^3^,^8^], sondern oft auch eine hohe Selektivität gegenüber anderen Serotoninrezeptor-Untertypen, was diese Verbindungen zu faszinierenden potentiellen Werkzeugen zur Erforschung der 5-HT2AR-vermittelten Funktionen macht. Verbindung 1 zeigt subnanomolare Affinität und hohe Aktivität des 5-HT2AR in einer neuronalen GF62-Zelllinie (Ki = 0,16 ± 0,04 nM mit Antagonist [3H]MDL100907; ED50 = 1,06 ± 0,19 nM als Effekt auf die Phosphoinositid (PI)-Hydrolyse; intrinsische Aktivität 83% im Vergleich zur Aktivierung durch 10 μM 5-HT) [^9^]. Die Untersuchung der Biodistribution von Verbindung 1 im Schweinegehirn zeigte jedoch schnellere Kinetik und Umkehrbarkeit der Bindung, weshalb sie nicht weiter als geeignetes Diagnosewerkzeug untersucht wurde [^9^]. Unabhängig von den unpraktischen Eigenschaften für die Pharmazie kann eine so hohe Potenz dieser Verbindung an diesen Rezeptoren das Interesse von Psychonauten wecken, die den veränderten Bewusstseinszustand mithilfe von psychedelischen Drogen erforschen.
Neben den kardiotoxischen [^10^] und neurotoxischen [^11^,^12^] Wirkungen auf Zelllinien können NBOMe durch Hemmung des humangenen Ether-à-go-related-Gens (hERG) Kaliumkanals [^10^] das kardiovaskuläre System beeinflussen und werden mit Vergiftungen mit zahlreichen Krampfanfällen in Verbindung gebracht. In schwereren Fällen können diese Anfälle zu Symptomen wie akutem Nieren- oder sogar Multiorganversagen führen [^13^]. Aufgrund der hohen Potenz dieser Substanzen und der relativ häufig auftretenden akuten Vergiftungen, die im Gegensatz zu anderen psychedelischen Substanzen stehen, stellen diese Substanzen ein ernsthaftes Gesundheitsrisiko für den Benutzer dar. Ihre Gefahr kann weiter durch ihre Präsenz in gefälschten Ecstasy- oder Lysergsäurediethylamid (LSD)-Produkten verschlimmert werden [^14^,^15^,^16^]. Obwohl eine NBOMe-Vergiftung in der Regel symptomatisch behandelt wird, ist es in vielen Fällen notwendig, die Ursachen der individuellen Vergiftung zu kennen und daher angemessene Methoden für das nichtzielgerichtete Screening zur Verfügung zu haben. Solche Methoden müssen aufgrund der niedrigen Konzentrationen der Ausgangssubstanz in Körperflüssigkeiten, die in einigen Fällen bereits unterhalb der Nachweisgrenze liegen können [^17^], ausreichend empfindlich sein. In solchen Fällen muss die Analyse auf die Identifizierung von Metaboliten angewiesen sein, die möglicherweise auch für einige der toxischen Wirkungen verantwortlich sein können [^18^]. Das Wissen über den Stoffwechsel dieser Substanzen und die synthetischen Ansätze zur Herstellung dieser Standards ist daher für Labore, die sich auf die forensische Toxikologie konzentrieren, relativ wichtig.
Da derzeit keine Daten zur Aktivität von 2C-B-Fly-NBOMe beim Menschen verfügbar sind, untersuchten Richter et al. [^19^] den Stoffwechsel von 2C-B-Fly-NBOMe in terminal differenzierten menschlichen Zellen aus Leberzellkarzinomen (HepaRG) und identifizierten insgesamt fünf Phase-I-Metaboliten und einen Phase-II-Metaboliten. Zwei mono-hydroxylierte Isomere, ein O-demethyliertes und ein O-demethyliertes-mono-hydroxyliertes Metabolit wurden vorläufig identifiziert (siehe Schema 2). Der Metabolit 2C-B-Fly-NBOH wird weiterhin mit Glucuronsäure konjugiert und bildet 2C-B-Fly-NBOH-Glucuronid, das der einzige in dieser Studie identifizierte Phase-II-Metabolit ist [^19^]. Da in der metabolischen Studie keine Standards verwendet wurden, bleiben die genauen Positionen der Hydroxymoieties der beschriebenen hydroxylierten Metaboliten unklar.
Da bisher nur fünf Metaboliten von 2C-B-Fly-NBOMe bekannt waren, zielten wir darauf ab, weitere Metaboliten dieser Verbindung zu identifizieren. In der vorliegenden Studie konzentrierten wir uns auf den Vergleich des Stoffwechsels von 2C-B-Fly-NBOMe in menschlichen Lebermikrosomen (HLM), im Myzel von Cunninghamella elegans (C. elegans) und in vivo bei Ratten. Pooled HLM sind sowohl ein verifiziertes als auch ein kostengünstiges System für die Untersuchung des Stoffwechsels von Verbindungen. Sie repräsentieren nicht nur eine wahre Population, sondern sind auch vollständig charakterisiert hinsichtlich der Aktivitäten von Cytochrom P450 und ausgewählten Phase-II-Enzymen. C. elegans ist ebenfalls ein kostengünstiges und zuverlässiges System, das für Stoffwechselstudien verwendet werden kann, da es Reaktionen wie N-Dealkylierung, Hydroxylierung oder Dehydrohalogenierung erleichtern kann. Rattenurin wird in der forensischen Wissenschaft häufig als Goldstandard für Stoffwechselstudien verwendet. Wir wollten die Unterschiede zwischen unseren In-vitro- und In-vivo-Modellen vergleichen und vorgeschlagene Metaboliten durch den Vergleich mit synthetisierten Standards bestätigen oder ausschließen. Zunächst wurde ein nichtzielgerichtetes Screening unter Verwendung von HPLC mit einem Hochauflösungs-Massendetektor durchgeführt. Wir haben Standards für mehrere vorgeschlagene Metaboliten sowie für deuteriummarkierte Standards 2C-B-Fly-NBOMe-d3 und 2C-H-Fly-NBOMe-d3 synthetisiert und vollständig charakterisiert und sie verwendet, um ihr Auftreten zu bestätigen oder zu widerlegen [^20^].
