Die klassische Modell des lac Operons basiert auf der Regulation der β-Galaktosidase-Produktion in Escherichia coli (E. coli). Zwei Schlüsselgene im lac Operon sind lacZ, das für die β-Galaktosidase kodiert, und lacI, das für den lac Repressor kodiert. Das lac Operon wird nicht direkt durch Laktose (d-Gal-(β1-4)-d-Glc) reguliert. Stattdessen ist Allolactose (d-Gal-(β1-6)-d-Glc) ein Induktor, der an den lac Repressor bindet, die Repression stoppt und die Transkription von lacZ und verwandten Genen ermöglicht. Neben seiner Funktion bei der Hydrolyse von Laktose synthesiert die β-Galaktosidase auch Allolactose (Abb. 1A). Die Anwesenheit von Allolactose ist jedoch temporär, da Allolactose auch ein Substrat ist und schließlich hydrolysiert wird (Abb. 1A).
Die E. coli β-Galaktosidase ist ein Tetramer mit vier identischen Untereinheiten, von denen jede 1023 Aminosäuren enthält. Die Struktur des Enzyms wurde bestimmt und viele molekulare Details der Reaktion wurden aufgeklärt. Das Enzym hat eine breite Spezifität und kann neben Laktose auch eine Vielzahl von β-d-Galaktosiden hydrolysieren. Die Substratbindung erfolgt in zwei Schritten. Laktose bindet zunächst in einer als “flache” Bindungsstelle bezeichneten Position, die parallel zu Trp-999 liegt und Wechselwirkungen damit eingeht. Diese Bindung ist nicht produktiv, und damit die Reaktion fortgesetzt werden kann, muss das Substrat etwa 3 Å verschoben und um etwa 90° gedreht werden. In dieser neuen Position, die als “tiefe” Bindungsstelle bezeichnet wird, bildet das Gal2 von Laktose Wechselwirkungen mit Trp-568 und ist richtig positioniert für die Reaktion im Hinblick auf zwei wichtige katalytische Reste, Glu-461 und Glu-537.
Während der Katalyse treten spezifische konformationelle Änderungen auf. Die Seitenkette von Phe-601 dreht sich um etwa 60°, während sie mit C6 des Gals interagiert, und eine mobile Schleife, bestehend aus den Resten 794-803, kann sich um etwa 11 Å bewegen und sich über das aktive Zentrum schließen. Drei Reste, Arg-599, Met-542 und Glu-808, sind keine Teil der Schleife, spielen jedoch eine wichtige Rolle bei der Konformation der Schleife. Strukturstudien haben gezeigt, dass die Schleife und Phe-601 des nativen Enzyms in der “geschlossenen” Konformation sind, wenn einige Übergangszustandsanaloga gebunden sind. Andernfalls sind Phe-601 und die Schleife in der “offenen” Konformation, wenn kein Ligand gebunden oder wenn das Substrat gebunden ist. Bestimmte Aminosäuresubstitutionen verändern das Gleichgewicht zwischen offener und geschlossener Konformation der Schleife.
Die β-Galaktosidase ist ein konservierendes Glycosylhydrolase mit einem Doppelversetzungsmechanismus. Bei der ersten Versetzung (k2 in Abb. 1B) reagiert ein Nukleophil, Glu-537, mit dem anomeren Kohlenstoff des Substrats, um die glycosidische Bindung zu brechen und eine kovalente Bindung mit Gal zu bilden. Glu-461 wirkt als Säurekatalysator, und die Reaktion erfolgt wahrscheinlich über einen oxocarbeniumion-ähnlichen Übergangszustand. Bei der zweiten Versetzung wirkt eine Akzeptorhydroxygruppe als Nukleophil, um die Enzym-Gal kovalente Bindung zu brechen. Bei Wasser als Akzeptor erfolgt eine Hydrolyse (k3) und es entsteht Gal. Bei Glc als Akzeptor entsteht Allolactose (k4).
Die meisten, wenn nicht alle, β-Galaktosidasen (einschließlich lacZ β-Galaktosidase) katalysieren die intermolekulare Allolactose-Synthese. Glc konkurriert einfach mit Wasser um die Bildung von Allolactose. Der intermolekulare Weg erfordert hohe Glc-Konzentrationen, entweder direkt in der Reaktion zugegeben oder durch die Hydrolyse von Laktose produziert. Der Anteil der Gesamtreaktion, der Allolactose bildet, hängt von der Glc-Konzentration ab. In einer Zelle mit einem nicht induzierten lac Operon würde dieser Reaktionsweg nicht ausreichen, um das Operon zu starten. Im Gegensatz dazu ist bei der Reaktion von lacZ β-Galaktosidase mit Laktose etwa 50% des anfänglichen Produkts Allolactose. Selbst bei niedrigen anfänglichen Laktosekonzentrationen ist dieser hohe Anteil nicht mit einem intermolekularen Transfer vereinbar. Stattdessen findet ein “intramolekularer” Transfer des Gal-Rests von Laktose von Glc O4 zu O6 statt, ohne dass Glc das aktive Zentrum verlässt. Kinetische Studien haben gezeigt, dass die Allolactose-Synthese in lacZ β-Galaktosidase durch eine langsame Freisetzung von Glc nach der Spaltung von Laktose durch die erste Versetzungsfunktion erleichtert wird. Diese vermeintliche Glc-Akzeptor-Stelle weist eine mäßige Spezifität für Glc auf, mit einer Dissoziationskonstante von 17 mm. Die Affinität ist ein Gleichgewicht zwischen dem Bedarf an intramolekularer Allolactose-Synthese für die Operon-Induktion, die durch eine hohe Glc-Affinität erleichtert wird, und dem Bedarf an der Produktion von Glc und Gal für die Glykolyse, die eine niedrige Glc-Affinität erfordert.
Die Art und Weise, wie die β-Galaktosidase Allolactose synthetisiert, ist wichtig, um die Regulation des lac Operons zu verstehen. Bisher hat die moderate Affinität von Glc die Kartierung der vermeintlichen Glc-Bindungsstelle verhindert. In dieser Studie wird erstmals eine detaillierte kristallographische Untersuchung präsentiert, wie β-Galaktosidase Glc an der Akzeptorstelle bindet und die beteiligten Reste identifiziert. Kinetische Studien in Verbindung mit gerichteter Mutagenese haben bestätigt, dass diese Reste wichtig für die Glc-Affinität sind. Diese Ergebnisse wurden dann für eine phylogenetische Analyse verwendet, die gezeigt hat, dass die für die intramolekulare Synthese von Allolactose wichtigen Reste nur bei einer relativ kleinen Gruppe bekannter Organismen in β-Galaktosidasen konserviert sind. Darüber hinaus wurden lac-Repressoren nur in Organismen identifiziert, in denen diese intramolekulare Allolactose-Produktion stattfinden kann. Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass die Allolactose-Produktion durch β-Galaktosidase nicht nur eine zufällige Nebenreaktion ist, wie oft in der Literatur und in Lehrbüchern dargestellt wird. Vielmehr sind die Allolactose-Produktion und damit der regulatorische Mechanismus im lac Operon Merkmale, die durch Evolution kooptiert wurden.
