Die DNA-Sequenzierung hat die biologischen Wissenschaften revolutioniert und die Ära der Genomik eingeleitet. Heute gibt es viele Verfahren zum Ablesen der Sequeninformationen. In diesem Artikel geben wir einen Überblick über die bekanntesten klassischen Sequenzierungsmethoden.
Kettenabbruchsynthese nach Sanger
Die Kettenabbruchsynthese, die 1975 vom britischen Biochemiker Frederick Sanger erfunden wurde, ist auch heute noch eine häufig genutzte Methode. Sie bildet die Grundlage moderner Sequenzierungstechniken. Sanger erhielt zusammen mit Gilbert dafür im Jahr 1980 den Nobelpreis für Chemie.
Die Methode basiert hauptsächlich auf einer enzymatischen Reaktion. Zunächst wird das zu sequenzierende, doppelsträngige DNA-Molekül (Doppelhelix) durch Hitze in die zwei Einzelstränge gespalten. Ausgehend von einem kurzen Abschnitt bekannter Sequenz, dem Primer, verlängert das Enzym DNA-Polymerase den fehlenden komplementären DNA-Strang.
In vier parallelen Ansätzen wird je eine der vier Basen zum Teil als Didesoxynukleosidtriphosphat (ddNTP) zugegeben. Diese ddNTPs besitzen keine 3′-Hydroxylgruppe, die für die Verknüpfung mit dem nächsten Nukleotid notwendig ist. Dadurch kommt es zu einem Kettenabbruch und es entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge. Nach der Sequenzierung werden die Fragmente mittels Gel-Elektrophorese aufgetrennt und die Sequenz kann abgelesen werden.
Sequenzierung nach Maxam und Gilbert
Im Jahr 1977 revolutionierten die Chemiker Allan Maxam und Walter Gilbert die Molekularbiologie mit ihrer Methode. Sie konnten die Basenabfolge eines DNA-Moleküls entschlüsseln, indem sie durch spezifische chemische Spaltung den DNA-Strang analysierten.
Die gespaltene DNA wurde mit radioaktivem Phosphat markiert und in vier getrennten Ansätzen wurden jeweils einzelne Basen entfernt. Danach wurden die Fragmente mit einer hochauflösenden Gel-Elektrophorese aufgetrennt und die DNA-Sequenz konnte abgelesen werden.
Aufgrund der geringen Automatisierbarkeit und den gesundheitsschädlichen Reagenzien wird diese Methode heute kaum noch verwendet.
Die Pyrosequenzierung
Die Pyrosequenzierung, entwickelt im Jahr 1996 von Pal Nyren und Mostafa Ronaghi, ist ein schnelles und kostengünstiges Sequenzierungsverfahren im Vergleich zur Methode nach Sanger. Hierbei wird die Aktivität der DNA-Polymerase beobachtet, wie sie Nukleotide an den neusynthetisierten DNA-Strang anhängt.
Die zu sequenzierende DNA dient als Matrize und liegt einzelsträngig vor. Analog zur Sanger-Sequenzierung wird der komplementäre DNA-Strang Nukleotid um Nukleotid verlängert. Bei Zugabe des passenden Nukleotids wird ein Lichtblitz erzeugt, der von einem Detektor erkannt und aufgezeichnet wird. Durch Zugabe der vier verschiedenen Nukleotide lässt sich die DNA-Sequenz ablesen.
Die Pyrosequenzierung eignet sich zur hochparallelen Analyse von DNA-Proben und wird häufig zur Bestimmung von Einzel-Nukleotid-Unterschieden (SNPs) eingesetzt.
Fazit
Die klassischen Sequenzierungsmethoden haben einen wichtigen Beitrag zur Erforschung und Entschlüsselung der DNA geleistet. Sowohl die Kettenabbruchsynthese nach Sanger als auch die Methode nach Maxam und Gilbert haben das Verständnis der DNA-Sequenzierung vorangebracht. Die Pyrosequenzierung ermöglicht heute eine schnellere und kostengünstigere Analyse von DNA-Proben.
