Einleitung:
Willkommen zu unserem neuesten Beitrag! Heute möchten wir die Begriffe Nachweisgrenze (limit of detection, LOD) und Bestimmungsgrenze (limit of quantification, LOQ) genauer unter die Lupe nehmen. Diese Ausdrücke sind für die Validierung analytischer Methoden von Bedeutung. Also, lasst uns loslegen!
Nachweisgrenze (LOD)
Die Nachweisgrenze, auch LOD genannt, bezeichnet die niedrigste Konzentration eines Analyten in einer Matrix, die mit einer gewissen Zuverlässigkeit nachgewiesen werden kann, aber nicht mehr quantifiziert werden kann. Sie definiert auch den Punkt, an dem die Konzentration zuverlässig über dem Hintergrundrauschen liegt. Bei qualitativen Untersuchungen von Verunreinigungen oder Grenzprüfungen wird üblicherweise eine Nachweisgrenze verwendet, aber manchmal kann sie auch bei quantitativen Bestimmungen erforderlich sein. Je nachdem, ob die Methode instrumentell oder nicht-instrumentell ist, geben die ICH Q2(R1) Methodenvalidierungsrichtlinien unterschiedliche Empfehlungen zur Bewertung der LOD. Es gibt drei verschiedene Evaluierungsmethoden:
1. Visuelle Prüfung:
Diese Methode wird hauptsächlich bei nicht-instrumentellen Verfahren angewandt. Ein Beispiel dafür ist der Nachweis der minimalen Konzentration eines Antibiotikums, die erforderlich ist, um das Bakterienwachstum zu hemmen. Diese Untersuchung erfolgt mit Antibiotika-Scheiben und der Berechnung der Hemmhof.
2. Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) Bestimmung:
Diese Methode kann nur bei Verfahren angewendet werden, die ein Basislinienrauschen aufweisen, wie z.B. HPLC-Methoden. Dabei werden die Signale der Proben, die niedrige Konzentrationen des Analyten enthalten, mit dem Signal einer Blindprobe verglichen. Dabei wird die geringste Konzentration ermittelt, bei der das Signal des Analyten noch zuverlässig nachgewiesen werden kann. Ein akzeptables Signal-Rausch-Verhältnis für die Schätzung der Nachweisgrenze beträgt in der Regel 3:1.
3. Standardabweichung (SD) und Steigung Bewertung:
Diese Evaluierungsmethode eignet sich auch für instrumentelle Verfahren. Es gibt zwei Möglichkeiten, dies durchzuführen:
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Evaluierung basierend auf der Standardabweichung (SD) des Nullwertes: Hierbei werden eine bestimmte Anzahl von Nullproben gemessen und die Standardabweichung der erhaltenen Werte berechnet.
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Evaluierung basierend auf der Kalibrierungskurve: Dabei werden Proben im Bereich der LOD verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu generieren. Die ICH Q2(R1) empfiehlt entweder die Standardabweichung der y-Abschnitte der Regressionsgeraden oder die Reststandardabweichung der Regressionsgeraden zu verwenden. Dieser Ansatz sorgte bereits für Diskussionen, da er in unseren Kundenprojekten noch nicht vorkam. Wir haben darüber berichtet und die Bedeutung klargestellt.
Die LOD wird wie folgt berechnet: LOD = 3,3 * σ / S. Dabei ist σ die Standardabweichung der Ergebnisse und S die Steigung der Kalibrierkurve. Weitere Informationen zu dem Faktor “3,3” gibt es in einem unserer Artikel.
Bestimmungsgrenze (LOQ)
Die Bestimmungsgrenze, auch LOQ genannt, ist die niedrigste Konzentration eines Analyten, die noch zuverlässig quantifiziert werden kann. Dafür ist eine angemessene Präzision und Richtigkeit erforderlich und muss nachgewiesen werden. Die Ermittlung der Bestimmungsgrenze ist für quantitative Untersuchungen von Verunreinigungen notwendig. Ähnlich wie bei der LOD gibt es verschiedene Methoden zur Bestimmung der LOQ, abhängig von der instrumentellen oder nicht-instrumentellen Natur der Methode.
1. Visuelle Prüfung:
Die LOQ kann durch die Analyse von Proben mit bekannten Konzentrationen des Analyten geschätzt werden. Dabei wird der minimalste Wert festgelegt, bei dem die Konzentration noch quantifiziert werden kann. Ein gutes Beispiel dafür ist die Titration zweier chemischer Substanzen. Hier wird eine bekannte Konzentration des Analyten zugegeben und es kommt zu einem Farbumschlag.
2. Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) Bestimmung:
Ähnlich wie bei der LOD kann die LOQ auch durch den Vergleich der Signale bekannter Konzentrationen des Analyten mit denen einer Blindprobe ermittelt werden. Dabei wird die kleinste Konzentration festgelegt, bei der der Analyt mit einer angemessenen Sicherheit quantifiziert werden kann. Ein S/N-Verhältnis von 10:1 wird als Richtwert angesehen. Chromatographische Methoden sind ein Beispiel dafür.
3. Standardabweichung (SD) und Steigung Bewertung:
Ähnlich wie bei der LOD gibt es zwei Möglichkeiten, die SD und die Steigung für die Berechnung der LOQ zu verwenden:
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Evaluierung basierend auf der Standardabweichung (SD) des Nullwertes: Hier werden mehrere Nullproben gemessen und die Standardabweichung der Ergebnisse berechnet.
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Evaluierung basierend auf der Kalibrierungskurve: Unter Verwendung von Proben, die den Analyten im Bereich der LOQ enthalten, wird mindestens eine Kalibrierungskurve generiert und untersucht. Die Auswertungsmethoden sind die gleichen wie bei der LOD.
Die LOQ wird wie folgt berechnet: LOQ = 10 * σ / S. Dabei ist σ die Standardabweichung der Ergebnisse und S die Steigung der Kalibrierkurve. Bei Anwendungen wie photometrischen Gehaltsbestimmungen von Verunreinigungen oder ELISAs wird dieser Ansatz angewendet.
Zusammenfassung:
Sowohl die Nachweisgrenze LOD als auch die Bestimmungsgrenze LOQ sind wichtig, da sie die Fähigkeit einer Methode, sehr niedrige Konzentrationen eines Analyten zu ermitteln (LOQ) bzw. nachzuweisen (LOD), beschreiben. Insbesondere bei Verfahren zur Bestimmung sehr geringer Mengen an Verunreinigungen sind diese Werte sehr nützlich. Für Wirksamkeits- oder Gehaltsbestimmungen sind sie hingegen nicht vorgeschrieben, was absolut Sinn macht, da diese Bestimmungen normalerweise bei einer Konzentration von 100% durchgeführt werden. Die Evaluierungstechniken für die Nachweis- und Bestimmungsgrenze sind sehr ähnlich, abgesehen von den akzeptierten Werten für S/N-Ansätze und den konstanten Werten für SD- und Steigungsansätze (3,3 für LOD und 10 für LOQ). Der Grund dafür ist logisch: Das Vertrauen in die Ergebnisse muss höher sein, wenn sie zuverlässig quantifiziert (LOQ) anstatt nur nachgewiesen (LOD) werden sollen. Die Verwendung der veralteten Begriffe analytische und funktionelle Sensitivität ist nicht empfehlenswert.
